Laporan Praktikum MIKROBIOLOGI NUTRISI - PENGENALAN PERCOBAAN INVITRO

Laporan Praktikum Ke : 4	Hari/Tanggal               : Selasa, 24 Maret 2015
Mikrobiologi Nutrisi	Tempat Praktikum       : Lab. BMN
	Nama Asisten              : Afdola R. N.   D24110041

                                                                                            

PENGENALAN PERCOBAAN INVITRO

Wungu Endah Cahyani

D24130061

Kelompok 02/G1

DEPARTEMEN ILMU NUTRISI & TEKNOLOGI PAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2015

PENDAHULUAN

Latar Belakang

            Teknik kecernaan in vitro memiliki keuntungan lebih singkat, lebih ekonomis, tidak adanya resiko kematian pada ternak, dan prediksi yang tidak berbeda jauh dengan metode in vivo atau yang biasa dilakukan untuk mengukur kecernaan pada ternak ruminansia.  Dasar dari metode ini adalah menirukan proses yang terjadi dalam rumen dan cara yang paling sering digunakan adalah teknik in vitro yang ditemukan oleh Tilley dan Terry (1963).  Pola degradasi di dalam rumen dapat dipelajari dengan menggunakan variasi waktu inkubasi pada metode standar.  Metode in vitro juga dapat digunakan untuk mengetahui konsentrasi produk akhir fermentasi.  Banyak peneliti telah memodifikasi prosedur Tilley dan Terry (1963), seperti yang telah dilakukan oleh Sutardi (1983).

            Metode in vitro adalah proses metabolisme yang terjadi di luar tubuh ternak.  Prinsip dan kondisinya sama dengan proses yang terjadi di dalam tubuh ternak yang meliputi proses metabolisme dalam rumen dan abomasum. pH rumen dan reticulum berkisar antara 5,5-7,0 dan bervariasi sesuai dengan rasio pemberian konsentrat. Metode in vitro (metode tabung) harus menyerupai sistem in vivo agar dapat menghasilkan pola yang sama sehingga nilai yang didapat juga tidak terlalu berbeda jauh dengan pengukuran secara in vivo.

Tujuan

            Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari prinsip dan prosedur percobaan in vitro.

TINJAUAN PUSTAKA

Cairan Rumen

Cairan rumen merupakan limbah yang diperoleh dari rumah potong hewan yang dapat mencemari lingkungan apabila tidak ditangani dengan baik. Bagian cair dari isi rumen kaya akan protein, vitamin B kompleks serta mengandung enzim-enzim hasil sintesa mikroba rumen. Cairan rumen merupakan bahan yang dapat dimanfaatkan sebagai activator, yaitu bahan yang dapat merangsang pertumbuhan mikroorganisme dekomposer dalam pengomposan. Hal ini disebabkan isi rumen masih mengandung karbohidrat, protein, mineral, dan vitamin larut air yang dibutuhkan oleh mikroorganisme. Menurut Church dan W.G. Pond (1988), menyatakan bahwa cairan rumen mengandung enzim alfa amylase, galaktosidase, hemiselulosa dan selulosa.

Kondisi dalam rumen adalah anaerobik dengan temperature 38-420C. Saliva yang masuk kedalam rumen berfungsi sebagai buffer dan membantu mempertahankan pH tetap pada 6,8. Saliva bertipe cair, membuffer asam-asam, hasil fermentasi mikroba rumen. Selain itu juga saliva merupakan zat pelumas dan surfactant yang membantu di dalam proses mastikasi dan ruminasi. Saliva mengandung elektrolit-elektrolit tertentu seperti Na, K, Ca, Mg, P, dan urea yang mempertinggi kecepatan fermentasi mikroba. Sekresi saliva dipengaruhi oleh bentuk fisik pakan, kandungan bahan kering, volume cairan isi perut dan stimulasi psikologis (Arora 1995).

Perbedaan In Vitro, In Vivo dan In Sacco

In vitro

            Metode pengukuran kecernaan secara in vitro pada prinsipnya adalah sama dengan in vivo tetapi dikerjakan di laboratorium (Sunarso et al., 1990). Metode kecernaan in vitro dilakukan dengan cara menginkubasi sampel yang akan dianalisa dalam cairan rumen selama 48 jam dan selanjutnya pada tahap kedua diinkubasi dengan pepsin dan HCl selama 48 jam untuk menghilangkan protein bacteria dan protein pakan yang tidak berubah (Soejono 1990).

            Menurut Hungate (1966) yang disitasi Sunarso et al. (1990), bahwa terdapat hubungan positif antara kecernaan pakan yang ditentukan secara in vitro dengan in vivo. Keuntungan teknik in vitro dalam mempelajari kegiatan mikroorganisme rumen adalah dapat mengurangi pengaruh yang disebabkan oleh hewan induk semang (Johnson, 1996 disitasi Sunarso et al., 1990). Hasil uji kecernaan in vitro cukup memuaskan dan membutuhkan waktu yang lebih singkat (Sunarso et al., 1990).

            Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan penelitian secara in vitro adalah larutan penyangga, suhu fermentasi, lama fermentasi dan prosedur analisis (Sunarso et al., 1990).

In vivo

Kualitas bahan pakan dicerminkan dari nilai kecernaan. Untuk mengukur  tingkat kecernaan suatu bahan pakan dibutuhkan ternak sebagai hewan  percobaan, metode ini disebut metode in vivo. Bahan pakan atau ransum yang  akan dicoba diberikan pada hewan, baik ternak kecil seperti marmut, tikus,  ayam, domba bahkan kuda atau sapi. Selisih antara intake BK dan feses yang  dihasilkan itu adalah BK yang dicerna. Denga membagi dengan jumlah intake BK maka akan diketahui prosentase kecernaanya (Close dan Menke 1986).

In sacco

            Tipe evaluasi pakan in sacco dengan kantong nylon merupakan kombinasi pengukuran nilai nutrisi pakan di lapang dan di laboratorium. Metode ini telah digunakan secara intensif dalam mengestimasi degradasi bahan pakan ternak ruminansia, terutama degradasi protein di dalam rumen. Di samping itu dapat juga untuk mengestimasi kecernaan serat kasar dan bahan kering, kehilangan nitrogen bahan makanan dan persediaan protein (Orskov dan McDonald 1979).

            Prinsip metode in sacco adalah suatu pakan dimasukkan ke dalam kantong kemudian diinkubasikan di dalam rumen ternak yang berfistula. Dalam masa inkubasi tertentu, pakan di dalam kantong akan mengalami degradasi karena fermentasi mikroba rumen dan partikel yang mudah larut dalam rumen. Sisa atau residu yang masih terdapat dalam kantong merupakan pakan yang tidak terdegradasi. Dengan metode ini ternyata laju dan tingkat degradasisuatu pakan di dalam rumen dapat diestimasi dengan cepat tanpa memerlukan banyak prosedur yang rumit. Nilai-nilai fraksi pakan yang terlarut, fraksi tidak larut tapi potensial untuk terdegradasi dan laju degradasi zat makanan merupakan parameter utama yang akan diukur dengan teknik in sacco ini (Orskov 1992).

            Pengukuran nilai nutrisi melalui teknik in sacco ini tidak hanya dilakukan melalui rumen, kini telah dikembangkan evaluasi kecernaan bahan pakan secara lebih menyeluruh. Evaluasi tersebut juga dilakukan di intestinum dengan metode in sacco mobil (mobile nylon bag technique). Prinsip metode ini adalah memasukkan residu pakan setelah inkubasi dalam rumen ke dalam intestinum melalui fistula intestinum dan diambil melalui feses. Keunggulan metode in sacco adalah dapat menggambarkan kinetic degradasi (kd), memperhitungkan gerakan laju pakan keluar rumen (kp) dan mempunyai koreksi yang erat dengan metode in vivo (Osuji et al. 1993).

McDougall

Pembuatan saliva buatan (McDougall) adalah dengan mencampurkan bahan- bahan kimia seperti : NaHCO3 58,8 gr, Na2HPO4.7H2O 42 gr, NaCl 2,82 gr, KCl 3,42 gr, CaCl2 0,24 gr, MgSO4.7H2O 0,72 gr dengan air destilasi sebanyak 5 liter, kemudian dikocok denagan CO2 secara perlahan. Saliva buatan ini bertujuan menurunkan pH hingga mencapai 6,8 (Pusparini 2012). Mc.Dougall dibuat dengan komposisi dan sifat-sifat mirip saliva rumen. Adanya sifat buffer dari Mc.Dougall karena mengandung fosfat dan bikarbonat. Selain itu, saliva tiruan ini juga dapat melicinkan pakan sebelum ditelan. Saliva sangat banyak disekresi oleh sapi dewasa khususnya bila ransum yang diberikan komposisi hijauannya tinggi. Asam-asam organik yang diproduksi oleh mikroorganisme dalam rumen dinetralisir oleh saliva, sehingga pH rumen dipertahankan antara 6,5 dan 7,5, merupakan medium yang cocok untuk pertumbuhan dan aktivitas mikroba. Penggunaan saliva buatan atau larutan Mc.Dougall pada proses in vitro bertujuan untuk mempertahankan pH selama proses fermentasi berlangsung (Widodo 2010).

MATERI DAN METODE

Materi

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah tabung fermentor, tabung Erlenmeyer, sendok, tabung film, shaker water bath, magnetic stirrer, pipet mohr, bulb, termos, kertas indicator pH, timbangan analitik, dan spoit. Bahan yang digunakan adalah larutan Mc Dougall, aquadest, larutan HgCl_2, cairan rumen, dan sampel.

Metode

Pembuatan Larutan Saliva Buatan

Sebanyak 0,098 gram NaHCO₃, 0,7 gram Na₂HPO₄, 0,057 gram HCl, 0,047 gram NaCl, dan 0,012 MgSO₄ ditimbang. Masing-masing bahan dilarutkan terlebih dahulu dalam aquadest dan dicampurkan hingga homogen dengan magnetic stirer.Setelah dimasukan bahan tersebut, sebanyak 0,004 gram CaCl₂ditimbang dan dicampurkan ke dalam larutan yang telah dibuat sebelumnya.Larutan dihomogenkan kembali dengan magnetic stirer.Aquadest ditambahkan hingga mencapai volume 100 ml dan dihomogenkan kembali.pH awal larutan saliva buatan diukur menggunakan kertas indikator pH.

Proses Fermentasi

Sebanyak 12 ml larutan saliva buatan dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung fermentor.Cairan rumen sebanyak 8 ml dipipet dan dicampurkan ke dalam larutan saliva buatan.Selama 30 detik, gas CO₂ dialirkan ke dalam tabung fermentor.Tabung fermentor dimasukkan ke dalam shaker waterbath dengan suhu 39° C selama 10 menit.

Pengamatan Jumlah Populasi Protozoa

Sejumlah kecil sampel cairan rumen diambil, diletakkan pada gelas objek, dan ditutup dengan cover glass.Preparat cairan rumen diletakkan di bawah mikroskop untuk dilakukan pengamatan terhadap populasi protozoa.Perbesaran mikroskop yang digunakan adalah 10x10.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

   Cairan rumen yang diamati dibawah mikroskop menunjukkan banyaknya protozoa yang terdapat di dalam rumen. Terlihat pula ada yang bergerak aktif maupun yang diam. Gambar berikut akan menggambarkan hasil pengamatan dengan mikroskop.

Gambar 1 Protozoa yang terlihat dibawah mikroskop (10x10)

Pembahasan

            Hasil pengamatan pada kecernaan invitro cairan rumen, didapatkan hasil bahwa cairan rumen yang ditambahkan larutan McDougall sebelum difermentasikan terdapat banyak sekali protozoa yang bergerak sangat cepat. Pada awalnya protozoa berukuran kecil lalu saat beberapa waktu protozoa tersebut mengalami penambahan ukuran. Setelah difermentasikan, protozoa yang terlihat lebih sedikit dibandingkan dengan sebelum fermentasi begitupun dengan pergerakannya yang lebih lambat.

            Metode pengukuran kecernaan secara in vitro pada prinsipnya adalah sama dengan in vivo tetapi dikerjakan di laboratorium (Sunarso et al., 1990). Metode kecernaan in vitro dilakukan dengan cara menginkubasi sampel yang akan dianalisa dalam cairan rumen selama 48 jam dan selanjutnya pada tahap kedua diinkubasi dengan pepsin dan HCl selama 48 jam untuk menghilangkan protein bacteria dan protein pakan yang tidak berubah (Soejono 1990).

            Kualitas bahan pakan dicerminkan dari nilai kecernaan. Untuk mengukur  tingkat kecernaan suatu bahan pakan dibutuhkan ternak sebagai hewan  percobaan, metode ini disebut metode in vivo. Bahan pakan atau ransum yang  akan dicoba diberikan pada hewan, baik ternak kecil seperti marmut, tikus,  ayam, domba bahkan kuda atau sapi. Selisih antara intake BK dan feses yang  dihasilkan itu adalah BK yang dicerna. Denga membagi dengan jumlah intake BK maka akan diketahui prosentase kecernaanya (Close dan Menke 1986).

            Prinsip metode in sacco adalah suatu pakan dimasukkan ke dalam kantong kemudian diinkubasikan di dalam rumen ternak yang berfistula. Dalam masa inkubasi tertentu, pakan di dalam kantong akan mengalami degradasi karena fermentasi mikroba rumen dan partikel yang mudah larut dalam rumen. Sisa atau residu yang masih terdapat dalam kantong merupakan pakan yang tidak terdegradasi (Orskov 1992).

            Metode invitro Sutardi (1983) menggunakan fermentor berupa tabung polyetilen berkapasitas 50 ml yang kemudian diisi dengan 1 g sampel, 12 ml larutan buffer McDougall dan 8 ml cairan rumen segar. Tabung lalu dikocok dengan dialiri CO₂ selama 30 detik dan ditutup dengan karet berventilasi. Tabung kemudian dimasukkan ke dalam shaker waterbath pada suhu 39⁰C untuk menciptakan suasana yang hampir sama dengan kondisi di dalam rumen dan diinkubasi selama 1, 3, dan 5 jam. Proses fermentasi dihentikan dengan meneteskan larutan HgCl2 jenuh sebanyak 2 tetes berfungsi untuk mematikan mikroorganisme yang berperan dalam proses fermentasi. Tabung fermentor disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan diambil untuk analisis konsentrasi NH3 dan VFA, sedangkan residu diambil untuk analisis DBK dan DBO.

DAFTAR PUSTAKA

Arora, S. P. 1995. Pencernaan Mikrobia pada Ruminansia. Gadjah Mada University Pres.Yogyakarta (Diterjemahkan oleh R. Murwani).

Church, D.C. dan W.G. Pond. 1988. Basic Animal Nutrition and Feeding. Third edition. John Wiley and Sons. New York.

Close, W and K. Menke. 1986. Selected Topics in Animal Nutrition. Universitaet Hohenheim. Hohenheim

Hungate, R.E. 1966. The Rumen and Its Microbe. Academic Press. pp. 78-79.

Orskov, E.R. and McDonald, L. 1979. Theestimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage. J. Agriculture Science Cambridge. 92: 499-503

Orskov, E.R. 1992. Protein Nutrition in Ruminants. Academic Press. London.

Osuji, P.O., L.V. Nsahlai and H. Khalili. 1993. Feed Evolution. International Livestock Centre for Africa. Addis Ababa.

Pusparini, Aidha. 2012. Analisa Spekel Akustooptik pada Biofilm Saliva Buatan dengan media Arkilik. Institut Teknologi Sepuluh November. Surabaya.

Soejono, M. 1990. Petunjuk Laboratorium Analisis dan Evaluasi Pakan. Fakultas

          Peternakan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Sunarso, E. Pangestu, J. Achmadi dan F. Wahyono. 1990. Penuntun Praktikum

          Ruminologi. Jurusan Nutrisi dan Makanan Ternak. Fakultas Peternakan.

          Universitas Diponegoro. Semarang.

Sutardi, T., N. A. Sigit dan T. Toharmat. 1983. Standarisasi Mutu Protein Bahan

          Makanan Ternak Ruminansia Berdasarkan Parameter Metabolismenya oleh

          Mikrobia Rumen. Proyek Pengembangan Ilmu dan Teknologi. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Jakarta.

Tillman, A. D, H. Hartadi, S. Prawirokusumo, S. Reksohadiprodjo dan S. Lebdosoekojo. 1998. Ilmu Makanan Ternak Dasar. Cetakan Ke-5. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Widodo, Eko. 2010. Kecernaan In Vitro. Kawan Pustaka, Yogjakarta.

LAMPIRAN

Gambar Literatur

Sebelum fermentasi	Sesudah fermentasi